原代大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞

方法簡介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖采用沖洗骨髓、密度梯度離心、差速貼壁法結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖經(jīng)CD34免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含F(xiàn)BS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-2代；不建議多次傳代

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

1. 組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長。

2. 消化培養(yǎng)法

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和 非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀 變成 絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠 瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。

3. 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法

對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

4. 器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。

1. 取材的組織要盡快培養(yǎng)。如若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果組織塊很大，應(yīng)切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24h。

2. 從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區(qū)域取材，可用含500～1000u/ml的青BSS液漂洗5～10min，或用10%注射液沖洗浸泡10min再作培養(yǎng)。

3. 組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。

4. 原代培養(yǎng)的1～2d內(nèi)要特別注意觀察是否有細(xì)菌、真菌、霉菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除。