【儀表網 儀表研發】傳統的光學顯微系統受到阿貝衍射極限原理的限制，無法分辨尺度小于~200nm的事物，為了突破衍射極限，超分辨熒光顯微技術應運而生，在生物成像等領域得到廣泛應用。根據成像采集過程，超分辨方法主要可分為兩類。一種是單分子定位顯微方法(SMLM)，通過熒光分子的光開關特性，孤立每個發光分子進行單獨定位。
此類方法具有不受衍射極限限制的特點，可以得到10-40nm的超高分辨率，但由于分子激活漂白的循環步驟使得采集速度和成像時間較慢。另一種是如結構光照明等寬場成像的超分辨顯微技術，可以通過獲得相鄰區域/熒光分子間一定程度的響應差異來實現分辨率的提升。寬場成像的方法具有較高的時間采集效率，但由于同時激發視野內的全部分子，使得其分辨能力往往在100nm以上。目前還缺乏一種方法在理論上可以有效地兼顧寬場成像的時間采集效率和單分子定位方法的空間分辨率，因此亟需提出一種基于寬場成像對熒光分子高效調制的技術方案。
超分辨方法其本質都是通過識別單個熒光分子的獨立的發射特性獲得該分子的空間定位。如果可以對寬場成像中衍射極限以內各個發光分子熒光發射差異實現主動控制，則有可能獲得更好的超分辨顯微結果。
近期，物理學院介觀物理國家重點實驗室光學研究團隊提出了基于量子相干控制原理主動調制分子熒光發射而獲得超分辨熒光顯微的方法(SNAC)，在寬場成像下實現了分辨率的提升。課題組在ZnCdS量子點體系下獲得衍射極限范圍內各個量子點的差異化激發。通過設計多個整形脈沖，單個ZnCdS量子點的熒光差異性會得到增強。課題組通過周期性改變整形脈沖和傅立葉增強提取熒光響應的差異。
同時，主動控制的圖像采集方案可以有效地抑制系統中不隨調制周期變化的泊松隨機噪聲和CMOS工藝導致的固定噪聲，極大地提升了信噪比。接著，課題組利用獨立開發的混合周期(Combination-FFT)和多高斯擬合定位算法獲得終的超分辨重建結果。研究模擬了鄰近雙點熒光發射的超分辨定位，其結果可以很好地分辨出低至50nm的相鄰熒光分子。
對于密集標記的線性結構，SNAC的分辨能力同樣有顯著的提高，獲得了30nm左右的徑向定位精度。在量子點標記的COS7細胞樣品的維管結構區域清晰地觀測到維管的平行取向和姿態排布以及纖維交叉區域的95.3nm的鄰近雙峰，顯示出比已有多種寬場超分辨方法更好的重建結果。這個研究將脈沖整形作為新的控制維度引入熒光超分辨，并將寬場超分辨成像技術的分辨率提升到了與單分子定位方法接近的50nm的水平。
圖1 主動控制超分辨方法的實驗裝置
圖2 鄰近雙點和復雜二維結構的主動控制超分辨率模擬驗證
圖3 QD625量子點標記的COS7細胞生物樣品的主動控制超分辨重建圖像
該項工作于2020年4月17日被Science Advances以題為“Super-resolution nanoscopy by coherent control on nanoparticle emission”在線發表(DOI:10.1126/sciadv.aaw6579)。論文的第一作者為北京大學博士生劉聰越，王樹峰副教授和龔旗煌院士是該論文的通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金、科技部和教育部納光電子前沿創新中心的支持。
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