聚合酶鏈反應(yīng)

PCR-SSCP分析的基本程序?yàn)椋菏紫萈CR擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶DNA中含單堿基置換，或數(shù)個(gè)堿基插入或缺失等改變時(shí)，因遷移率變化會出現(xiàn)泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。由此可見，PCR-SSCP分析技術(shù)是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)，它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。該技術(shù)已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領(lǐng)域。為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結(jié)果，現(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSCP技術(shù)，各有其優(yōu)勢及適用領(lǐng)域。例如，可以在PCR擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹的放射性同位素PCR-SSCP法。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí)，利用γ-32P-ATP標(biāo)記引物或直接在PCR反應(yīng)體系中加入α-32P-dCTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物，均可使產(chǎn)物信號增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級。二者相比較，前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，多用于大樣本的檢測和篩選；后者操作簡便，適于一般實(shí)驗(yàn)室開展，可用于小樣本或大樣本的檢測和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。一、試劑準(zhǔn)備⒈ PCR相關(guān)試劑⒉ α-32P-dCTP⒊ 30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 OC保存。⒋ 10％過胺配制方法：1g 過胺，溶于10ml ddH2O中，4 OC保存（可用數(shù)周）。⒌ TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）⒍ 5×TBE緩沖液：Tris堿54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。7．變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二青、0.05%溴酚藍(lán)、 20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步驟⒈ PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10μl，在0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分：10×buffer 1μldNTPmix 70μMDNA模板 100ng引物及Taq DNA酶 依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入α-32P-dCTP 0.1μl加ddH2O至 10μl