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技術(shù)員解析流式抗體的選擇及注意事項

時間:2014/2/24閱讀:960
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由于在流式細胞實驗過程中,熒光抗體對單細胞懸液的標記效果直接影響實驗的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此,需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測效果的因素,例如抗體特異性、熒光素信號強弱、熒光素標記方式、同型對照等。這些對初次實驗無任何經(jīng)驗的學(xué)者來說相比是很困難完成實驗的,對此上海勁馬生物特派技術(shù)部技術(shù)員李工為我們解析流式抗體該如何選擇及其注意事項。方便初學(xué)者學(xué)習(xí)。
李工說流式抗體的選擇應(yīng)該具有以下幾點

1. 流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇zui基本的條件:目標蛋白特異性,反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實驗。

2. 流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中,盡量減少實驗工序和過程,以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。

3. 流式抗體熒光標記的選擇:如果實驗中檢測單一指標:不同熒光標記在不同的儀器上強度不同。FACS Calibur儀器為例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,通常來說,PEzui強,適用于弱表達抗原。FITC強度較弱,適用于強表達抗原,使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測的目標蛋白進行具體選擇。如果同時檢測多個指標:確認流式細胞儀能檢測多少個通道:流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如:實驗者同時檢測三個指標,可以在圖1中綠色、黃色和紅色三個通道中各選一個適當(dāng)?shù)臒晒馑貥擞洠現(xiàn)ITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記,以防止熒光的重疊和相互干擾,影響zui后結(jié)果。因此,流式細胞儀的通道越多,同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標志就越多。常用熒光標記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

流式抗體與同型對照的選擇:

流式細胞實驗和其他抗體相關(guān)實驗有點不同的就是需要選擇同型對照。同型對照,是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色,相當(dāng)于實驗的陰性對照。同型對照選擇與標記抗體同種屬來源,同亞型,同熒光標記的抗體。比如:抗人的CD3的PE標記的抗體,小鼠的IgG2a。同型對照選擇PE標記的小鼠的IgG2a。

看懂了流式抗體的選擇方法,那么流式抗體使用注意事項也是實驗中的關(guān)鍵問題,稍有不慎,實驗就可能功虧一簣,每一步實驗要領(lǐng)都是決定實驗成功與否的關(guān)鍵,李工將注意事項一一列出:
1建議實驗細胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細胞過量或抗體過量都可能使實驗結(jié)果受影響,因此需要優(yōu)化試驗條件。注:不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異,例如傳統(tǒng)流式細胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個細胞為起始上樣量,抗體用量為10μl,而微流式細胞術(shù)則只需5×105個細胞,抗體用量減少到5μl。

2 直標的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存,不要冷凍。

3 盡量選擇經(jīng)實驗驗證的流式抗體,以保證實驗結(jié)果。上海勁馬系列流式抗體已經(jīng)通過了實驗驗證,并且提供了相關(guān)數(shù)據(jù)圖供用戶參考。您還有任何不明白的問題咨詢,我們將認真為您解答您實驗中需求的每一個問題。上海勁馬實驗設(shè)備有限公司您身邊的實驗用品專家!

 


 

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