酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

1.分類和操作原理
       酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或稱酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。是當(dāng)前應(yīng)用zui廣泛的一種測(cè)定方法，它是以物理方法將抗體（或抗原）吸附在固相載體上，隨后的一系列免疫學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行，免疫酶測(cè)定試驗(yàn)包括間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法以及近年來發(fā)展的一些改良法。
（1）間接法：將已知抗原吸附（或稱包被）于固相載體，孵育后洗去未吸附的抗原，隨后加入含有特異性抗體的被檢血清，感作后洗除未起反應(yīng)的物質(zhì)，加入酶標(biāo)抗體同種球蛋白（如被檢血清是兔血清，就需用抗兔球蛋白），感作后再經(jīng)洗滌，加入酶底物，底物被分解，出現(xiàn)顏色變化，顏色變化的速度及程度，與樣品中的抗體量有關(guān)，即樣品含有抗體愈多，顏色出現(xiàn)得也愈快、愈深。
（2） 雙抗體夾心法：是檢測(cè)抗原的方法，將特異性免疫球蛋白吸附于固相載體表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗體在固相表面上形成復(fù)合物。洗除多余的抗原，再加入酶標(biāo)記的特異性抗體，感作后漂洗，加入酶底物，顏色的改變與待測(cè)樣品中的抗原量成正比。
（3）競(jìng)爭(zhēng)法：利用酶標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原共同競(jìng)爭(zhēng)有*抗體的原理，測(cè)定樣品中的抗原。操作時(shí)需要有只加酶標(biāo)記抗原的系統(tǒng)作為對(duì)照。將抗體吸附于固相載體表面，感作后漂洗，加入待檢抗原樣品和酶標(biāo)記抗原（也可先加待檢樣品，稍后再加酶標(biāo)記抗原）。對(duì)照則只加酶標(biāo)記抗原。感作后漂洗加入酶底物溶液。含酶標(biāo)記抗原的對(duì)照系統(tǒng)出現(xiàn)顏色反應(yīng)。而在待檢系統(tǒng)中，由于樣品中未標(biāo)記抗原的競(jìng)爭(zhēng)作用，相應(yīng)抑制顏色反應(yīng)。待檢抗原含量高時(shí)，其對(duì)抗體的競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)，所形成的不帶酶的抗原抗體復(fù)合物量亦多，帶酶復(fù)合物的形成量相對(duì)減少，從而使酶催化底物時(shí)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量也減少，而帶酶復(fù)合物量卻相對(duì)增多，酶催化底物時(shí)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量也增多。因此，待檢系統(tǒng)中顏色變化的程度與其中抗原的含量成負(fù)相關(guān)。
此外，免疫酶染色法中抗酶染色法的免疫球蛋白橋法和PAP法等也都可以用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，除以上這些基本方法之外，科學(xué)工作者又在此基礎(chǔ)上，通過“技術(shù)雜交”設(shè)計(jì)出了許多改良方法，舉例如下：
阻斷ELISA：將已知抗原包被于固相載體，孵育后洗去未吸附的抗原，隨后加入被檢血清，感作后洗去未起反應(yīng)的物質(zhì)，加入抗已知抗原的酶標(biāo)抗體。感作后再洗滌，加入酶底物，底物顏色變化的速度與程度，與被檢血清中的抗體量有關(guān)，樣品中含有的抗體愈多，與固相載體上抗原結(jié)合得愈多，剩下給已知抗體結(jié)合的位點(diǎn)愈少，顏色出現(xiàn)的愈慢、愈淺。
夾心間接ELISA：本法主要應(yīng)用酶標(biāo)記抗抗體測(cè)定抗原。先將特異性抗體（如兔IgG）吸附于固相載體表面，孵育后沖洗，隨后加入待檢抗原樣品，感作后沖洗。再加入不同種動(dòng)物（如豚鼠）的相同的特異性抗體。感作沖洗后，加入酶標(biāo)記抗第二種抗體的動(dòng)物球蛋白（如兔抗豚鼠免疫球蛋白）。再行感作沖洗后，加入酶的底物。其所產(chǎn)生的顏色變化與第二步中加入的抗原量成正相關(guān)。由于預(yù)先吸附在固相載體表面的抗體能夠特異性地捕捉標(biāo)本中的抗原，所以，這種方法又稱為抗原捕捉ELISA（AC—ELISA）。
抗體捕捉ELISA：主要應(yīng)用于IgM的檢測(cè)。它可以解決由于IgM在液體中含量較低，用常規(guī)間接法測(cè)定常不能獲得滿意效果的問題。抗體捕獲ELISA的操作原理是：首先用抗u鏈抗體（是單抗）包被載體，隨后加入待檢體液（血清或腦脊髓液等），感作后沖洗，再加入酶標(biāo)抗原或抗原～酶標(biāo)抗體復(fù)合物，再行感作沖洗后，加入酶的底物。反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化與體液中的特異性IgM含量成正比。
一步法ELISA  ：本法是雙抗體夾心法的拓展，其基礎(chǔ)是分別使用針對(duì)不同抗原決定簇的單克隆抗體包被載體和進(jìn)行酶標(biāo)記。具體方法是用針對(duì)待檢抗原不同抗原決定簇的一種或幾種單克隆抗體包被載體，包被完畢的載體經(jīng)適當(dāng)處理可長(zhǎng)期保存或作商品供應(yīng)。檢測(cè)時(shí)，同時(shí)加入被檢標(biāo)本和酶標(biāo)記的針對(duì)待檢抗原的另一種或幾種抗原決定簇的單克隆抗體，感作后沖洗，再加入酶作用的底物，反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色變化與待檢抗原的含量成正比。本法由于待檢抗原和酶標(biāo)抗體同時(shí)一步加入，故稱一步法，其優(yōu)點(diǎn)是操作十分快捷，一般可在1小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，某些商品化的一步法ELISA系統(tǒng)，整個(gè)檢測(cè)只需幾分鐘。
2.ELISA的操作要領(lǐng)
（1）固相載體的選擇：目前廣泛應(yīng)用的固相載體是聚苯乙烯微量反應(yīng)板，有的供應(yīng)商還把聚苯乙烯制成條或小杯，可隨意組合應(yīng)用。另一種廣泛應(yīng)用的固相載體是PVC塑料軟板。這些材料的吸附效果與塑料的類型、表面性質(zhì)有關(guān)，生產(chǎn)加工工藝的不同以及其他選擇性能好的固相載體。吸附性能可用以下方法測(cè)定：在固相載體的每一個(gè)小孔中，加入同一份同一稀釋度的抗原或抗體，使之吸附于小孔表面，然后按常規(guī)方法操作，加底物顯色后測(cè)定每一孔中溶液的A值。一般認(rèn)為，每?jī)煽盏腁值誤差均在±10％內(nèi)，否則不可使用。
固相載體用標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性抗體或抗原孔的光密度差值要大，二者相差10倍以上屬合格。
近年來，還有一些研究人員應(yīng)用硝酸纖維素膜作為ELISA的載體，直接在膜上點(diǎn)樣，進(jìn)行一系列的操作，結(jié)果表明這種載體使用方便，敏感性、特異性等并不亞于用塑料作載體的ELISA試驗(yàn)，由此衍生出了斑點(diǎn)—ELISA（Dot—ELISA）。還有人用疏水聚酯布作為ELISA載體，使ELISA結(jié)果更易保存，由此衍生出了布—ELISA（C—ELISA）。
（2）預(yù)備試驗(yàn)：在正式進(jìn)行ELISA試驗(yàn)前，必須進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以確定酶結(jié)合物，包被抗原或抗體的zui適濃度、底物的zui適反應(yīng)時(shí)間等。
酶結(jié)合物的確定：以pH9.6的碳酸鹽緩沖液將IgG稀釋至100ug／ml，加入固相載體的每一孔中進(jìn)行包被，洗滌后將酶結(jié)合物以1：200、1：400、1：800、……作系列稀釋，依次加入各孔，每一稀釋度加2孔。反應(yīng)完畢后加底物顯色，讀取結(jié)果，以能產(chǎn)生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為結(jié)合物的zui適濃度。
包被蛋白質(zhì)濃度的確定：酶結(jié)合物濃度確定后，應(yīng)測(cè)定包被蛋白質(zhì)（抗體或抗原）的zui適濃度。其步驟是：將欲被包被的蛋白質(zhì)用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作1：10、1：20、1：40……系列稀釋，以每一稀釋度包被固相載體的2個(gè)孔，然后進(jìn)行常規(guī)的ELISA操作。zui后讀取結(jié)果，同樣以能產(chǎn)生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為包被蛋白質(zhì)的zui適濃度。
底物zui適作用時(shí)間的確定：以zui適稀釋度抗原和酶結(jié)合物進(jìn)行試驗(yàn)，加入底物后在不同時(shí)間終止反應(yīng)，即可確定zui適反應(yīng)時(shí)間。
（3）包被：將蛋白質(zhì)（抗原或抗體）吸附于固相載體表面的過程稱為包被。除應(yīng)注意選擇合適的載體外，還應(yīng)注意：
包被液的pH：通常用pH9.5～9.6，0.05mol／L或0.1mol／L的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原或抗體，吸附時(shí)的pH一般為9.0左右。如pH較低，則吸附時(shí)間延長(zhǎng)，但pH低于6.0則非特異性吸附增加。
吸附時(shí)間與溫度：一般為4℃過夜，有時(shí)也可采用37℃吸附1～5小時(shí)。
蛋白質(zhì)液：在固相載體上，每孔加入量一般為0.1～100ug／ml。若濃度太高，會(huì)因抗原或抗體蛋白分子之間的相互作用較大而影響載體對(duì)蛋白質(zhì)的吸附；如濃度太低，則敏感性下降。
對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒抗原，或其他高濃度抗原，也可試用下述方法進(jìn)行包被，將細(xì)胞培養(yǎng)物或其他抗原液加入反應(yīng)板的各孔后，每孔滴入1滴20％～25％的甲醛溶液，室溫固定15分鐘，其間不斷溫和地晃動(dòng)。zui后用洗滌液或蒸餾水洗滌除去甲醛，包被即告完成，該法簡(jiǎn)便省時(shí)，包被效果確實(shí)。
（4）洗滌：在ELISA試驗(yàn)過程中，與免疫酶染色法一樣，為了除去前一步所加的未結(jié)合的抗原、抗體或結(jié)合物，防止其與隨后加入的相應(yīng)物質(zhì)或底物產(chǎn)生不應(yīng)有的反應(yīng)，則每一步都必須進(jìn)行洗滌（清洗）。其方法是，先將載體各孔甩干，再加洗滌液充滿各孔，靜置3～5分鐘，如此重復(fù)三次。然后將載體甩干，立即加入下一步的試劑。
目前較多使用的洗滌液是含有0.05％吐溫-20，0.01mol／LpH7.4的PBS。應(yīng)用含有0.05％吐溫-20，0.01mol／LpH7.4的Tris—HCl效果也很好。
（5）封閉：抗原或抗體包被后，載體表面仍可能有未吸附蛋白質(zhì)的空白位點(diǎn)，從而造成下一步的非特異性吸附，即使用較高濃度的蛋白質(zhì)包被，也有必要對(duì)包被后的載體進(jìn)行處理，以封閉可能存在的空白位點(diǎn)。常用的封閉液有：1％～3％牛血清白蛋白、3％～5％脫脂乳、10％牛或馬血清等。加入封閉液后，可在37℃吸附2小時(shí)，然后洗滌。
（6）結(jié)果判定：ELISA結(jié)果的判定方法很多，常用的有以下幾種：
目視比色法：在ELISA試驗(yàn)完成后，直接以肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化，作出陰性或陽性的判斷。這種方法主要用于ELISA的定性實(shí)驗(yàn)中。
光電比色法：用分光光度計(jì)在適宜的波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)后的光密度值，然后以下列方法之一對(duì)樣品進(jìn)行定性或定量：
a．值法：在小心控制的條件下，結(jié)果以值來表示。在抗體測(cè)定中，先確定未感染群體的值平均值（X），然后在此水平上選擇一個(gè)指示感染值（一般是X±2SD或X±3SD），如果被檢血清的值在該值之上，為陽性；在其下，為陰性。
b．P／N比法：即被檢樣品（P）的光吸收值（A）和陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品（N）平均（A）值之比，以大于某一比值（一般為≥2）為陽性。
c．終點(diǎn)法：所有血清通過連續(xù)稀釋滴定，并測(cè)定每一稀釋度的A值，根據(jù)陰性血清的測(cè)定結(jié)果，選定一個(gè)值（見值法），以產(chǎn)生這個(gè)值的稀釋倍數(shù)作為“效價(jià)”。
d．單稀釋法：被檢樣品不作連續(xù)稀釋，而根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果選擇一個(gè)合適的稀釋度。所有樣品都按該稀釋度稀釋，反應(yīng)后測(cè)定光吸收值，將此值與用標(biāo)準(zhǔn)樣品作成的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，或用回歸方程計(jì)算，得出被檢樣品的“效價(jià)”。有人將這種方法稱為單稀釋ELISA。

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