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考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量流程

時間:2013/5/23閱讀:1577
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考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量流程

  該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或*。去污劑的濃度超過02%影響測定結果。如TritonX-100SDSNP-40等。
  1Bradford濃染液的配制:將100rug考馬斯亮藍G-250溶于50m1 95%乙醇,加入100ml濃磷酸,然后,用蒸餾水補充至200ml,此染液放413至少6個月保持穩(wěn)定。
  2.標準曲線蛋白質(zhì)樣本的準備:盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug150ug100ul之間繪制標準曲線。
  3.將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中,該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同PBS)
  4.按15用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現(xiàn)沉淀,過濾除去。
  5.每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液,作用530rain。染液與蛋白質(zhì)結合后,將由紅色變?yōu)樗{色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min
  6.根據(jù)標準曲線計算待測樣本的濃度。
考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結合,反應快速,并且穩(wěn)定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。
  考馬斯亮藍R-250是電泳的
 考馬斯亮藍G250R250都可以染蛋白,一般用R250G250染色后背景較深不易脫色。一般R250 染蛋白,G250 一般測蛋白濃度,也可染膠,敏感性更高但較慢脫色較難。
 考馬斯亮藍G250常用的蛋白染料,作定性試驗用,染色后為藍綠色;R250較敏感,做定量實驗用,染膠效果較好.染色后為紅藍色
 
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