本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1（TGF-β1）水平。用純化的小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1（TGF-β1）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1（TGF-β1），再與 HRP標(biāo)記的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1（TGF-β1）抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1（TGF-β1）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1（TGF-β1）濃度。

試劑盒組成

1	30倍濃縮洗滌液	20ml×1瓶	7	終止液	6ml×1瓶
2	酶標(biāo)試劑	6ml×1瓶	8	標(biāo)準(zhǔn)品（240pg/ml）	0.5ml×1瓶
3	酶標(biāo)包被板	12孔×8條	9	標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	1.5ml×1瓶
4	樣品稀釋液	6ml×1瓶	10	說(shuō)明書(shū)	1份
5	顯色劑 A液	6ml×1瓶	11	封板膜	2張
6	顯色劑 B液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1個(gè)

標(biāo)本要求

1 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2 NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（ HRP）活性。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 3 0分鐘。

4.配液：將 30倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此重復(fù) 5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同 3。

8.洗滌：操作同 5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測(cè)定：以空白空調(diào)零， 450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

120pg/ml	5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品	150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
60pg/ml	4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品	150μl的 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
30pg/ml	3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品	150μl的 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
15pg/ml	2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品	150μl的 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
7.5pg/ml	1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品	150μl的 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) .

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期： 6個(gè)月

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操作程序總結(jié)：

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的

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