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上海金穗生物科技有限公司
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酶活性分析法檢定蛋白質

時間:2012/9/7閱讀:396
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表現出?的酶GUS可以水解其基質衍生物pNPG,所產生的黃色生成物p-nitrophenol,可供活性測定 (Jefferson et al, 1986);

 
    儀器用具:ELISA光?計 (Dynatech);微?滴定盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404)
 
    藥品試劑:基質溶液 (GUS reaction buffer):pNPG (p-nitrophenyl β-D-glucuronide, Sigma N-1627) 31.5 mg溶于Buffer A-0 100 mL終止液 (stop buffer):2.5 M 2-amino-2-methyl propanediol (Sigma A-9754)
 
    方法步驟:
    1) 吸取20 μL 的蛋白質樣本,小心注入微?滴定盤中,避免氣泡產生。
    2) 每一樣品槽加入200 μL 基質液,混合均勻;可用燒熱的接種環去除氣泡。
    3) 靜置約1~2 min,顏色開始加深,然后加入30 μL 終止液。 反應時間的長短,要以樣本中的酶活性大小?做調整。因為我們只測定色析法各分劃的相對酶活性,因此并?加終止液。
    4) 以ELISA 光?計測定波長415 nm 的吸光值。
 
    酶活性單位的測定:
    a. 以上步驟,只可測定GUS 活性的相對大小,對色析法所得到的各個分劃進?偵測,相當方?,但并非酶活性單位的測定方法。
    b. ?要測定酶的活性單位,要使用適當的酶用?,使酶在反應一段固定的時間后,其生成物的呈色吸光?,?在光?計的可測范圍的內;然后計算此段時間內,每分鐘所產生的吸光?增加?,轉換成生成物的莫耳數,即可求得其真正的活性單位。
    c. 因此酶的活性單位定義為:每分鐘所能催化生成物的 μmole 數。

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