如我們以前的論文所述，我們經(jīng)常將后幾輪篩選得到的序列轉(zhuǎn)移到能與大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合表達(dá)的載體中去。這樣就能夠通過ELISA反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)（反應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度通常與每個(gè)克隆所編碼的肽段的親和力相關(guān)）。并且，通過此法能夠輕易地純化毫克級(jí)的融合蛋白，這樣在化學(xué)合成肽段之前，就可以對(duì)很多肽段的性質(zhì)進(jìn)行初始分析。

通過對(duì)富集的質(zhì)粒使用BspEI和ScaI雙酶切，然后將片段轉(zhuǎn)移到pELM3或pELM5其中的一個(gè)MBP載體中，就可以完成到MBP載體的轉(zhuǎn)移Ds]。為使庫片段更容易純化，上述酶切產(chǎn)物再通過NheI酶切，以防止隨機(jī)序列與片段共同轉(zhuǎn)移。約900bp的庫片段純化后，被連接到約5．6kb的pELM3或pELM5片段的AgeI與ScaI位點(diǎn)之間。通過轉(zhuǎn)化ARl 814大腸桿菌，可以得到單個(gè)克隆用以ELISA反應(yīng)分析或者通過標(biāo)記的受體進(jìn)行克隆黏附的分析。

麥芽糖結(jié)合蛋白ELISA的方法與以前論文所述一致[1Sj，除了從大腸桿菌中釋放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我們發(fā)現(xiàn)，使用商業(yè)性的去垢劑（Pierce公司的B-PER抽提試劑）較*能更簡(jiǎn)單有效地裂解細(xì)菌細(xì)胞。3 ml培養(yǎng)基中的經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞先通過沉降，再通過含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重懸。于室溫下放置20分鐘后，離心5分鐘以除去細(xì)胞碎片，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中。裂解物于一70~0凍存，當(dāng)用于ELISA反應(yīng)時(shí)按1：50稀釋。

在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，我們發(fā)現(xiàn)麥芽糖結(jié)合蛋白ELISA反應(yīng)中的強(qiáng)信號(hào)經(jīng)常能夠代表肽段與所研究的受體的高親和性。當(dāng)然，對(duì)于嚴(yán)格的分析肽段的性質(zhì)而言，終的化學(xué)合成肽段是必要的。如果是大規(guī)模的篩選克隆，先采用標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行克隆黏附分析，可以為后面的ELISA分析提供更少的克隆集合。
http:///