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上海金穗生物科技有限公司
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在固相抗原上選擇噬菌體抗體

時間:2012-12-25閱讀:260
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1.用溶于PBS的2m1抗原(10—1000ug/m1) 包被免疫管,室溫過夜。碳酸鹽緩沖液也可使用。
2.用PBS洗滌試管3次,并用2%MPBS封閉非特異性結合位點,放在旋轉的轉臺上,37℃l小時。
3.用PBS洗滌試管3次;加入lml滴度為10lz~1013的噬菌體抗體(稀釋于lml 4%MPBS中),在旋轉的轉臺上孵育30分鐘,再靜止1.5小時。
4.用PBS/PBS/Tween洗滌試管1次,并用PBS洗滌2次。每次洗滌是將緩沖液倒入和倒出試管。
5.加入1.Oml 100mmol/L三乙基胺,給試管加蓋,然后再轉臺上轉動8分鐘。
6.將洗脫液轉移至1個新試管中,并立即加入0.5mllmol/LTris—HCl(pH 7.4) 中和并混勻。
7.將一半體積的洗脫液(0.75m1)加入到10m1對數生長的大腸桿菌TGl或DH5αF,(A600值為0.5)中;37℃孵育培養液30分鐘,不用振蕩。
8.取1P1培養液在100mmTYE/amp/glu平板上鋪板以滴定洗脫的噬菌體。
9.以4000r/minl5分鐘離心剩余的培養液。重懸于0.5ml 2XTY培養基中,并在兩塊150mmTYE/amp/glu平板上鋪板。
10.準備下一輪選擇所需的噬菌粒顆粒:感染輔助噬菌體,但要將起始培養體積降至10m1(步驟1),并擴充培養體積至50ml。由于體積變小,可用臺式離心機操作。將噬茵體重懸于終體積為1.Oml的PBS中,并用大腸桿菌TGl測定噬菌體滴度。
11.從步驟1開始,重復進行選擇,共2~4輪。*輪過后,要增加洗滌的嚴謹性:洗脫前,用PBS/Tween洗滌20次并用PBS洗滌20;hQ。用PBS和PBS/Tween進行一次或兩次時間為30分鐘的洗滌步驟,也能提高嚴謹性。

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