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上海金穗生物科技有限公司
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氯化鈣法進行質體的轉形

時間:2013-2-20閱讀:240
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方法步驟:
1) 進行轉形實驗前16~20 h,自 -70℃取出貯存的菌種,以劃單一菌落方式將菌株JM109 接種在SOB固體培養基上,在37℃培養。
2) 取40 mL SOB培養基裝入125 mL已滅過菌的三角瓶 (請記得加入Mg2+)。 另取1 mL SOB加于微量離心管中。 由SOB固體培養基上選4~6 個約2~3 mm大小的單一菌落接入1 mL SOB中,震蕩將菌體打散后,加入40 mL SOB中,于37℃震蕩培養約2~3 h,直至細胞數約為4~7×107/mL。 可于接菌2 h后每隔20~30 min測A600估計
3) 收集菌液于離心管中,置冰浴中10~15 min。
4) 以750~1,000 g 離心12~15 min (4℃)。
5) 倒去上清,并盡量將液體倒干,或以微量移液器頭吸干凈。
6) 沉淀加入1/3 菌液體積冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震蕩,混合均勻,置冰浴中10~15 min。
7) 同上4), 5) 的操作。再重復6), 4), 5) 的操作,以使反應更*,增加成功率。
8) 加入1/25 菌液體積冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震蕩使混合均勻。
◆ Competent cells 制備完成!
9) DNA 樣品 (<10 μL) 先裝于微量離心管中,置冰浴中預冷,另取一微量離心管,標上 #0,不加入任何DNA (作為negative control),亦置冰浴中預冷。
每個樣品加入200 μL 菌液,震蕩混合后,置冰浴中20~40 min。
10) 42℃加熱90 s (溫度及時間均需很準確,請事先檢查水浴鍋的溫度,不可超過42℃)。
◆ Heat shock!
11) 置冰浴中2 min。
12) 加入800 μL SOC,混合后,于37℃震蕩培養30~60 min。
13) 將各管轉形液上下搖動混合均勻后。#5 取20 μL 至另一離心管中,加入180μL SOC (稀釋10 倍),混合均勻后,涂布于SOC/Amp plate。 #0, #1~#4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate。 剩余菌液以6,000 rpm 離心1 min,倒去上清,沉淀加入200 μL SOC,均勻打散后涂抹在另一個SOC/Amp plate 上。
14) 待培養基表面的菌液*被吸收后,倒置培養皿于37℃培養16~20 h 后,觀察各個plate 上菌落的形狀并計算菌落數。

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