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上海金穗生物科技有限公司
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大量制備血清噬菌粒克隆

時間:2013-3-18閱讀:299
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[器材和試劑]
● LB+Amp
● LB+Amp/Glu[LB ,50ug/ml Amp,l%葡萄糖]
● IPTG
● M13K07輔助噬菌體(Stratagene)
● PEG 8000(Sigma)
● NaCl
● TBS
● SW40異質同晶聚合物管(Beckman)

[方法]
1.將含有單克隆噬菌粒的菌落接種到10ul LB+Amp/Glu中,37℃過夜培養(yǎng)(在lac啟動 子的控制下,葡萄糖能抑制pⅧ基因的表達)。
2.用500ml LB+Amp稀釋過夜培養(yǎng)液,使之OD600=0.05;并在37℃下用2L燒瓶劇烈 振蕩培養(yǎng)(至少300r/min),直到OD600=0.25。
3.37℃極溫和攪動孵育15分鐘。加入IPTG(終濃度為0.1mmol/L)誘導源自lac啟動 ·子的pⅧ表達,并用輔助噬菌體M13K07(mol=30)進行超感染。混合并在37℃下靜置15分鐘感染。37℃劇烈振蕩孵育培養(yǎng)物5小時。
4.將細菌/噬菌體上清在4℃5000r/min離心30分鐘,回收上清液。
5.加PEG 8000和NaCl溶液(其終濃度分別為4%和0.5mol/L)沉淀噬菌體顆粒,4℃冰上4小時。
6.4℃5000r/min離心40分鐘回收噬菌體沉淀,并用1/10原體積的TBS重懸。
7.70℃水浴孵育噬菌體上清30分鐘,使污染的細菌蛋白變性;再4℃10000r/min離心30分鐘除之。
8.將PEG 8000/NaCl加入所得到的上清,再次沉淀噬茵體,4℃冰上孵育2小時。
9.4℃10000r/min離心30分鐘, 用10ml PBS重懸噬菌體沉淀。 以8000r/min再次離心15分鐘,以去除不溶物質。
10.在LB+Amp平板上滴定噬菌體TU值。

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