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今日,上海滬鼎為您介紹:大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟

時(shí)間:2014/3/13閱讀:1401
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我們都知道大腸桿菌轉(zhuǎn)化可以:(1)將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制,增殖和表達(dá),以獲得目的基因;

(2)驗(yàn)證大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞效果;

(3)用于分子生物學(xué)其他研究。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化操作步驟

(1)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min。

(3) 加入5μl連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過(guò)100ng),輕輕震蕩后放置冰上20min。

(4) 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min。

(5) 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.

(6) 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中,用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂)。

(7) 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話(huà),滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。

(8) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過(guò)來(lái)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。

(9) 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

(10)觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開(kāi)為好。注意白色菌斑。

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