ELISA實驗通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。正確的加樣方法應為45度，吸頭貼著孔壁加入，應注意角度太小，會使液體殘留在孔壁上，導致加樣不準確；吸頭應當貼著管壁和液面的交界處！

     
    要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。

    血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8 ℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70 ℃以下。樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。