實(shí)驗(yàn)原理:

    在不附加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)結(jié)成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變化，如機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH 改變、蛋白質(zhì)變性等等，終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但如向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，可避免上述現(xiàn)象的發(fā)生。凍存在－135 ℃以下低溫中，能減少冰晶的形成。而融化細(xì)胞時(shí)速度則要快，使之迅速通過(guò)易受損的－5~0 ℃以后，細(xì)胞活力不受損害，仍能生長(zhǎng)增殖。當(dāng)前常用的保護(hù)劑仍為甘油和DMSO，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、分子量小、溶解度大、易穿透細(xì)胞，使用范圍在5%~15 %之間，常用10 %。

    實(shí)驗(yàn)步驟:

    1.細(xì)胞

    選項(xiàng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；收集細(xì)胞24 小時(shí)前換液一次；

    2、制備細(xì)胞懸液：
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    （1）用75%酒精棉球消毒超凈工作臺(tái)臺(tái)面，然后用75%酒精棉球消毒雙手及暴露部位；

    （2）用75%酒精棉球消毒各培養(yǎng)用液的瓶蓋以及培養(yǎng)瓶瓶蓋部位，并在酒精燈外焰上方一過(guò)，擰開(kāi)瓶蓋，將瓶口再在酒精燈外焰上方一過(guò)后，擰上瓶蓋，但不要擰緊，以便下步操作；?

    （3）輕輕將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液倒入燒杯中，注意不要讓瓶口碰到燒杯，不要讓液體濺出；

    （4）吸取PE液3ml加入瓶?jī)?nèi)，加入時(shí)注意從側(cè)面加入而不能直接沖細(xì)胞貼壁處，避免造成細(xì)胞脫壁，然后蓋上蓋子，平放輕搖40下，輕輕倒出，要求倒干凈；

    （5）加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶液，加入時(shí)直沖細(xì)胞貼壁處，平放輕搖，使酶液漫過(guò)整個(gè)瓶底部，一分鐘之內(nèi)將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡臺(tái)上進(jìn)行觀察，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)漸漸回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞慢慢變圓，用手掌拍打瓶底和瓶側(cè)，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)并分散，呈懸浮狀；

    （6）立即加入5mlMEM+10%小牛血清，用吸管向瓶壁輕輕吹吸幾次，從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞全部從瓶壁脫落并形成均勻的細(xì)胞懸液；

    3、按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)5×106 /ml （如一瓶細(xì)胞數(shù)量不足則用兩瓶或更多的細(xì)胞），離心去上清， 吸入離心管中；先用培養(yǎng)液9 分+DMSO 1 分（或甘油）配成10%的DMSO凍存液；按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸；分裝入無(wú)菌安瓿中，每安瓿加1.5 毫升細(xì)胞懸液；

    4、封口

    用塑料安瓿時(shí)擰緊瓶口即可；如用火焰封閉安瓿口后，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時(shí)可浸入藍(lán)色液中觀察，為安全起見(jiàn)，把安瓿縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細(xì)胞名稱(chēng)，凍存日期，以便日后查找；

    5、凍存

    當(dāng)前已有細(xì)胞凍存器；在無(wú)凍存器的情況下，可用手工辦法；從把凍存物懸在液氮罐口開(kāi)始算起，按－1 ℃分鐘速度，在30~40 分鐘內(nèi)，下降到液氮面，再停30 分鐘后，直投入液氮中。