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滬鼎生物|細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)

時間:2023/12/13閱讀:467
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細(xì)胞融合(cell fusion),細(xì)胞遺傳學(xué)名詞,是在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下,兩個細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜za種細(xì)胞?;具^程包括細(xì)胞融合形成異核體(heterokaryon)、異核體通過細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的雜za種細(xì)胞。細(xì)胞融合可作為一種實(shí)驗(yàn)方法被廣泛適用于單克隆抗體的制備,膜蛋白的研究。


一、細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)所需試劑:


(1)胎牛血清或小牛血清


(2)培養(yǎng)基:細(xì)胞融合常用的培養(yǎng)液有DMEM、RPMI 1640 及無血清培養(yǎng)基等。DMEM有高糖(4500mg/L)及低糖(1000mg/L)之分。雜交瘤細(xì)胞在上述幾種培養(yǎng)基中均能良好的生長與增殖


(3)HAT及HT培養(yǎng)液:HAT、HT以五十分之一的比例加入培養(yǎng)基( DMEM或RPMI 1640)


(4)聚乙二醇(PEG)溶液:稱取一定量的PEG,高壓蒸汽滅菌(8磅30分鐘),待其冷至50℃左右,與等體積的RPMI1640混合,即為50%的PEG溶液,封口后4℃放置備用。用于細(xì)胞融合的PEG的分子量可在1000-6000之間,目前已有商品化的50%PEG溶液可直接用于細(xì)胞融合。


二、細(xì)胞融合的方法:


1.動物細(xì)胞雜交或細(xì)胞融合


將兩個不同種的親本細(xì)胞A和B,以滅活的仙臺病毒或聚乙二醇(PEG)為融合誘導(dǎo)劑,使A和B兩細(xì)胞融合成為一個具兩個遺傳性不同核的異核體(如遺傳性相同的核融合在一起叫同核體)。隨后異核體經(jīng)有絲分裂成為兩個具有A和B兩親本的za種融合核。AB雜za種經(jīng)多次分裂,B親本的染色體會逐漸減少到一個或完wan全消失。


2.PEG促進(jìn)細(xì)胞融合注意事項(xiàng):


(1)事先做好兩種原生質(zhì)體融合的識別標(biāo)記,如色素、缺陷型、抗性標(biāo)記等。


(2)原生質(zhì)體或細(xì)胞密度應(yīng)在105個/ml,兩種原生質(zhì)體或細(xì)胞按1:1等量混合


(3)PEG誘導(dǎo)融合的效果,同分子量大小及濃度高低密切相關(guān)。分子量和濃度愈大,促進(jìn)細(xì)胞融合的能力愈高,而其粘度及對細(xì)胞的毒性也隨之增大,故通常以選用分子4000-6000濃度30-50%的PEG進(jìn)行融合為宜。


(4)PEG使細(xì)胞融合或致死劑量界限很狹小,為達(dá)到成功有效的融合,還必須嚴(yán)格掌握PEG的處理時間。一般加入PEG后,24℃培育10-20min(注意時間宜短不宜長,過長使原生質(zhì)體周圍包裹一層膜形成凝集體,降低融合率),緩緩加入高鈣離子溶液15min后用沖洗液清洗,離心收集細(xì)胞或原生質(zhì)體。

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