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上海滬鼎提供:腫瘤壞死因子試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟

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酶聯(lián)免疫吸附測定腫瘤壞死因子試劑盒操作中標(biāo)本的收集

    用于ELISA測定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清漿,有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測目的,也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前使用血清漿標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。

    對用于激素和治療藥物測定的血清標(biāo)本的收集,要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨400600之間,會有一峰值出現(xiàn);生長激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性方式釋放,因此,在測定此類激素時(shí),有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本,以其中間值為測定值。

    又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí),血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測,應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的收集則沒有時(shí)間和體位方面的影響。

ELISA試劑盒操作步驟:

方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法

  1. 包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml4℃ 過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

  3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml37℃ 孵育0.51小時(shí),洗滌。

  4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml37℃ 1030分鐘。

  5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml

  6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

方法二 用于檢測未知抗體的間接法

  1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110μg/ml,每孔加0.1ml4℃過夜;

  2.次日洗滌3次;

  3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,37℃孵育1小時(shí),洗滌;

  4.(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml

  5.37℃孵育30-60分鐘,洗滌;

  6.’zui后一遍用DDW洗滌。

  其余步驟同“雙抗體夾心法”的456

試劑

  (1) 包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):

  Na2CO3 1.59

  NaHCO3 2.93

  加蒸餾水至1000ml

  (2) 洗滌緩沖液(PH7.4PBS):0.15M

  KH2PO4 0.2

  Na2HPO4·12H2O 2.9

  NaCl 8.0

  KCl 0.2

  Tween-20 0.05% 0.5ml

  加蒸餾水至1000ml

  (3) 稀釋液:

  牛血清白蛋白(BSA) 0.1

  加洗滌緩沖液至100ml

  或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510%使用。

  (4) 終止液(2M H2SO4):

  蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98%21.7ml

  (5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

  0.2MNa2HPO428.4/L25.7ml

  0.1M檸檬酸(19.2/L) 24.3ml

  加蒸餾水50ml

  (6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:

  TMB10mg/5ml無水乙醇)0.5ml

  底物緩沖液(PH5.5) 10ml

  0.75%H2O2 32μl

  (7) ABTS使用液:

  ABTS 0.5mg

  底物緩沖液(PH5.5) 1ml

  3%H2O2 2μl

  (8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

9) 正常人血清和陽性對照血清。

器材

  (1) 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔,ELISA檢測儀,50μl100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。

  (2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

  (3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。

實(shí)驗(yàn)條件的選擇

  在ELISA中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括:

  (1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

  (2) 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH9.09.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 1824小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.11.010μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為110μg/ml

  (3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

  (4) 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMBABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。

自備材料

  1. 蒸餾水。

  2. 加樣器:5ul10ul50ul100ul200ul500ul1000ul

  3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

  1. 避免直接接觸終止液和底物AB。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。

  2. 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

  3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

腫瘤壞死因子試劑盒操作注意事項(xiàng)

  1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。

  2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。

  3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

  4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物AB液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。

  5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

  6. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

  7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

  8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

  9. 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

   Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存,操作簡便,結(jié)果判斷較客觀等因素,已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA檢測試劑盒是用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗體ELISA檢測。

上海滬鼎生物科技有限公司專業(yè)經(jīng)銷眾多生命科學(xué)領(lǐng)域的品牌ELISA試劑盒,生物試劑,抗體,培養(yǎng)基,血清。為中國科研試劑供應(yīng)商之一,質(zhì)量被全國各大院校科研機(jī)構(gòu)認(rèn)可,并為Elisa試劑盒長期供應(yīng)商,作為戰(zhàn)略合作伙伴。腫瘤壞死因子試劑盒*,超好質(zhì)量,進(jìn)口分裝/原裝試劑盒,保證質(zhì)量,歡迎您來電選購,期待與您合作!

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