ELISA試劑盒實驗開端前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品制作時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應猜測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的查看規劃，核算時再乘以相應的稀釋倍數。
反應時間的控制：參與底物后請守時查詢反應孔的顏色改變（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請提前參與中止液中止反應，避免反應過強然后影響酶標儀光密度讀數。
棄去液體，甩干，不必洗刷。每孔加查看溶液A工作液100 （臨用前制作），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。
棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
ELISA試劑盒加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，留心不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，悄然晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為確保實驗效果有效性，每次實驗請運用新的標準品溶液。
每孔加查看溶液B工作液（臨用前制作）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。
棄去孔內液體，甩干，洗板5次，辦法同進程3。
每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可中止）。
每孔加中止溶液50 ，中止反應，此刻藍色立轉黃色。中止液的參與次第應盡量與底物液的參與次第相同。
ELISA試劑盒當即用酶標儀在450nm波長丈量各孔的光密度（值）。
