在免疫酶技術(shù)中，首先要斷定的變異要素就是酶符號(hào)物的作業(yè)濃度。因?yàn)槊阜?hào)物濃度的很小改變，便可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成果發(fā)生很大的波動(dòng)。別的，因?yàn)闈舛冗^高，可使非特異性反響添加，而濃度過低又可影響測(cè)定的敏感性。因此，正式實(shí)驗(yàn)前有必要滴定其作業(yè)濃度。
(一)酶符號(hào)抗體的滴定辦法：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反響，以酶與底物的顯色反響程度來斷定酶符號(hào)抗體的效價(jià)，或稱作業(yè)濃度。
(二)過程：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過夜，次日以洗刷緩沖液洗刷3次。酶符號(hào)抗體用1%BSA-PBS液順次稀釋成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600(依據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別參加反響孔中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時(shí)后洗刷。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO4 0.05ml終止反響。
(三)成果斷定：主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值，并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，制作滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該符號(hào)物的作業(yè)濃度。
注意事項(xiàng)
1. 在具有高質(zhì)量HRP的條件下，所要符號(hào)的抗體也要活性高、效價(jià)高(zui低1:16)、純度高、親和力好，這是保證符號(hào)物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件。
2. 所運(yùn)用試劑的PH和濃度及用量有必要嚴(yán)厲把握。所用試劑，(或必需)新鮮制造。如在戊二醛符號(hào)法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛貯存過久可構(gòu)成縮和體(雜質(zhì))。不然，影響符號(hào)作用。
3. 室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。符號(hào)物每次透析前，須認(rèn)真查看，避免漏液。
4. 濃的符號(hào)物相當(dāng)安穩(wěn)，常參加30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年，但稀釋成1:10，只能保存數(shù)周。已制造的運(yùn)用液應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。
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