1. 加規范品：在酶標包被板上設規范品孔，順次參加不同濃度的規范品50ul(主張每個濃度做2個平行孔)
2. 加樣：ELISA試劑盒別離設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其他各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl，然后再加樣品親和素10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，悄悄晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加酶：ELISA試劑盒除空白孔外每孔參加酶標試劑50μl。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先參加顯色劑A50μl，ELISA試劑盒再參加顯色劑B50μl，悄悄震動混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 停止：每孔加停止液50μl，停止反響(此時藍色立轉黃色)。
11. 測定：ELISA試劑盒以空白空調零，450nm波長依序丈量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加停止液后15分鐘以內進行。
