鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化介紹

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細(xì)胞, 在體內(nèi)具有分布廣泛, 體外能夠大量擴(kuò)增和免疫原性低等特點(diǎn), 是一種細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。自20世紀(jì)60年代，F(xiàn)riedenstein等發(fā)現(xiàn)在人骨髓*培養(yǎng)中, 存在一種形態(tài)類似成纖維細(xì)胞的貼壁生長的細(xì)胞且移植到小鼠體內(nèi)具有成骨能力和造血支持作用, 將這種細(xì)胞命名為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世紀(jì)90年代末, 人們才成功分離一種具有成骨、成軟骨和成脂肪能力的細(xì)胞, 稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。

隨后研究者也從其他組織, 如脂肪、臍帶、胎盤、肝臟、骨實(shí)質(zhì)和肌肉等中成功分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。作為一類成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠這兩種模式動(dòng)物上, 其他動(dòng)物的間充質(zhì)干細(xì)胞報(bào)道相對(duì)較少。選取中國*家禽品種鴨子為實(shí)驗(yàn)材料, 以鴨胚胎肝臟中的間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象, 對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定, 進(jìn)行增殖能力檢測及分化能力鑒定, 為家禽干細(xì)胞研究及畜禽遺傳資源保存提供借鑒及參考。鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染8-12h，連續(xù)傳13代，采用高濃度含嘌呤霉素培養(yǎng)基（4μg/mL）培養(yǎng)，篩選陽性克隆；篩選出陽性永生化鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞。

細(xì)胞特性

1）  來源：上海中科院動(dòng)物研究所

2）  含量：>5x105個(gè)/mL

3）  污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測為陰性

4）  規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運(yùn)輸和保存：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式：（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達(dá)到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

細(xì)胞用途：僅供科研使用。

鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1)      準(zhǔn)備鴨胚胎肝臟間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基（dmem 高糖和F12培養(yǎng)基1：1搭配， 10%血清   ，1%雙抗    以及1％自己配置的間質(zhì)細(xì)胞因子。）。

2)      培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3)      凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至6ml。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2ml*培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

  下面T25瓶為例；

1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml*，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml*培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至zui終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項(xiàng)：

1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.鴨胚胎肝間質(zhì)細(xì)胞永生化所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。