在大elisa免疫檢測(cè)試劑盒中通常有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行產(chǎn)生氣泡。
加標(biāo)本通常用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，避免發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。
有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震動(dòng)器上震動(dòng)1分鐘以確保混和。加酶物使用液和底物使用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液進(jìn)程敏捷完結(jié)。在ELISA試劑盒中通常有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶物后。抗原抗體反響的完結(jié)需要有必定的溫度和時(shí)刻，這一保溫進(jìn)程稱(chēng)為溫育（incubation），有人稱(chēng)之為孵育，在ELISA檢查試劑盒中似不恰當(dāng)。
大elisa免疫檢測(cè)試劑盒屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的只在固相表面上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗的機(jī)會(huì)，只要Z靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個(gè)逐，因此需經(jīng)分散
才干到達(dá)反響的結(jié)尾。在其后參加的酶符號(hào)抗體與固相抗原的也相同如此。這即是為什么ELISA檢查試劑盒反響老是需要必定時(shí)刻的溫育。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體的適宜溫度。在樹(shù)立ELISA方法作反響動(dòng)力學(xué)研討時(shí)，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)品的生成可達(dá)高峰。為加快反響，可提高反響的溫度，有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中，以構(gòu)成Z多的沉積。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng)，在大elisa免疫檢測(cè)試劑盒中通常不予選用。