多能干細(xì)胞（iPSC）經(jīng)誘導(dǎo)可分化為心肌細(xì)胞（CM），從而產(chǎn)生人心肌的體外細(xì)胞模型即iPSC-CM。常規(guī)2D培養(yǎng)的iPSC-CM表型通常不成熟。3D培養(yǎng)可提高iPSC-CM的表型成熟度，但通常操作過程復(fù)雜，對設(shè)備要求高，細(xì)胞產(chǎn)量小，研究效率低。來自英國的研究人員Matthew  P.  Burnham等通過添加磁性金-鐵氧化物納米粒可將磁性細(xì)胞球精確定位在記錄電極上，并基于此方法研究了共培養(yǎng)、胞外緩沖液成分、電起搏等因素對iPSC-CM的影響。以“A  Scalable Approach RevealsFunctional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids”為題發(fā)表在SLAS Discovery上。

研究背景

       成年心肌在細(xì)胞層面主要包括表型成熟的心肌細(xì)胞（CM）以及緊鄰的心肌成纖維細(xì)胞。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞（iPSC-CM）為建立成人心肌細(xì)胞體外模型奠定了重大研究基礎(chǔ)。但該模型中的iPSC-CM細(xì)胞通常表型不成熟，存在具有自發(fā)性qiboqi活性但搏動力度不足，肌漿網(wǎng)（SR）鈣（Ca2+）調(diào)節(jié)發(fā)育不*和肌膜離子通道表達(dá)不足等缺陷。

       大量研究表明在2D單層細(xì)胞培養(yǎng)條件下，iPSC-CM體外表型成熟度會受到限制。而通過模擬各種生理條件如：3D矩陣和結(jié)構(gòu)化支架、與非肌細(xì)胞支持細(xì)胞共培養(yǎng)、在彈性基層上的電起搏收縮行為和機械調(diào)節(jié)、以及適當(dāng)利用能源等均能顯著提高iPSC-CM的表型成熟度。對3D   iPSC-CM功能和結(jié)構(gòu)研究方法很多，如iPSC-CM與非肌細(xì)胞支持細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白一起形成條狀或環(huán)狀，用光學(xué)方式追蹤其收縮性；通過在低粘附力表面或在懸滴中培養(yǎng)，iPSC-CM細(xì)胞能夠自我組裝形成3D結(jié)構(gòu)，與視頻顯微術(shù)相結(jié)合也可檢測其收縮性；還有基于染料或光遺傳的報告分子、微電極、多電極陣列或力傳感器等方法來研究3D  iPSC-CM的結(jié)構(gòu)。但這些方法操作過程復(fù)雜，對設(shè)備要求高，效率極低，導(dǎo)致iPSC-CM產(chǎn)量偏低。

       因此想要進(jìn)行更高效的iPSC-CM進(jìn)行研究，我們需要新方法。在低粘附力表面或水凝膠上形成的球狀體/微組織是zuijiandan的獲取iPSC-CM   3D結(jié)構(gòu)的方法，但由此產(chǎn)生的球狀結(jié)構(gòu)處于自由漂浮狀態(tài)，跳動活躍難以操作，也難以可靠檢測。本文研究人員通過將iPSC-CM與非肌細(xì)胞支持細(xì)胞和磁性金-鐵氧化物納米顆粒組裝在一起形成unique共培養(yǎng)細(xì)胞球，并使所得的共培養(yǎng)細(xì)胞球帶有磁性，能夠被釹磁鐵陣列定向和定位，從而將細(xì)胞球精確定位到2D iPSC-CM單分子層功能測量的96孔傳感板的感應(yīng)電極上（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH），通過記錄收縮力（阻抗）和細(xì)胞外場電位（EFP）檢測細(xì)胞球生理指標(biāo)。這是shouci以整板形式進(jìn)行3D  iPSC-CM功能檢測，同時結(jié)合96孔液體處理平臺和聲學(xué)分配軟件，實現(xiàn)了高通量操作。為研究3D  iPSC-CM模型是否可以應(yīng)用于成年心肌的更多生理學(xué)研究，研究人員還探究了成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)（人原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞系）、細(xì)胞外緩沖液組成和電起搏等因素的影響，證明該方法具有高效、可擴展性。

結(jié)果

       為構(gòu)建3D iPSC-CM細(xì)胞球模型，研究人員向iPSC-CM和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入金-鐵氧化物納米粒子，形成的磁性細(xì)胞球可被磁性陣列吸引并定位到感應(yīng)電極上，檢測率可達(dá)95%以上，且定位附著后的細(xì)胞球依然能夠維持良好的3D結(jié)構(gòu)。

圖1. iPSC-CM共培養(yǎng)球形團簇的自組裝及平板陣列的制備。（a）工作流程示意圖，將共培養(yǎng)細(xì)胞在超低附著裝配板中與鐵-金納米粒子一起組裝成共培養(yǎng)細(xì)胞球，并使用與電極位置對齊的定制磁鐵陣列將球體沉積到記錄電極上，然后將其轉(zhuǎn)移到傳感器板上（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH）。（b）iPSC-CM細(xì)胞在接種后4天內(nèi)（第1-4天）以iPSC-CM單獨或與成纖維細(xì)胞（fb）共培養(yǎng)形式組裝到傳感器板中。（c）釹磁鐵陣列示意圖（尺寸與傳感器板中12×8電極陣列位置相同）。(d)  石蠟切片HE染色表明金-鐵氧化物納米粒子進(jìn)入球體（白色箭頭），且球中心無壞死。(e)  iPSC-CM球體附著到包被過的傳感板電極4天后，進(jìn)行中性紅染色，發(fā)現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)保持良好，并無2D單層細(xì)胞出現(xiàn)。

       研究人員對iPSC-CM   3D磁性細(xì)胞球模型進(jìn)行了多項成熟度檢測。通過傳感器阻抗檢測，發(fā)現(xiàn)加入金-鐵氧化物納米顆粒并不會改變細(xì)胞球的搏動特性，培養(yǎng)2天的細(xì)胞球搏動穩(wěn)定，搏動率為0.8±0.04Hz或49±2.4  bpm，幅度<5 ohm。400 nM異丙腎上腺素（L型Ca2+通道抑制劑）處理后搏動頻率提高，1μM維拉帕米（β-腎上腺素受體激動劑）處理后搏動停止，與已知的藥理學(xué)作用一致（圖2，表1）。在給藥方面，研究人員基于96孔液體處理平臺（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH）構(gòu)建了一種高效配液給藥方法，從培養(yǎng)記錄板中吸出一部分溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基，將其與DMSO儲備溶液快速混合，然后再次分配回培養(yǎng)記錄板。該方法操作簡單，用時短，可做到同時給藥且濃度均一，極大地避免了人工操作帶來的各種影響，且給藥期間記錄板中溫度變化在0.5℃范圍內(nèi)。

圖2   通過阻抗感應(yīng)檢測iPSC-CM球的收縮參數(shù)。(a)單個球收縮和規(guī)律搏動時的10s阻抗曲線向下偏轉(zhuǎn)。(b)搏動特征在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定。(c)藍(lán)色曲線：400  nM異丙腎上腺素；黑色曲線：1  μM維拉帕米；灰色曲線：對照。(d)c圖的平均數(shù)據(jù)。(e)使用自動液體操作進(jìn)行累計添加維拉帕米，產(chǎn)生的濃度-響應(yīng)數(shù)據(jù)，n=9次重復(fù)。研究人員探究了成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)對iPSC-CM細(xì)胞球的影響。發(fā)現(xiàn)與小鼠和人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，iPSC-CM細(xì)胞球搏動幅度分別增加約15倍和6倍（圖3a）。代表搏動偏轉(zhuǎn)的矢量幅度增加了10倍以上（圖3b）成纖維細(xì)胞接種比率也影響搏動率。iPSC-CM細(xì)胞球的搏動幅度隨人成纖維細(xì)胞接種比例的增加而增加，但其搏動幅度隨小鼠成纖維細(xì)胞的接種比例增加而降低（圖3c和d，表1）。然而在不同的時間點，不同成纖維細(xì)胞的播種比例都會讓iPSC-CM細(xì)胞球產(chǎn)生強烈的收縮，表明其收縮力對成纖維細(xì)胞本身的存在更為敏感，而不是精確的成纖維細(xì)胞接種比率。

圖3  與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可以顯著調(diào)節(jié)iPSC-CM的固有收縮行為。(a)阻抗記錄表示搏動幅度，iPSC-CM球(CM  only)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)球（CM-Fb），原代人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)球(CM-hCFb)。(b)光學(xué)方法檢測組裝板中的搏動特性，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)對iPSC-CM搏動幅度有顯著影響，(i,只有iPSC-CM;  ii, MEF共培養(yǎng))。(c和d)增加人(i或空心正方形)或小鼠(ii或?qū)嵭恼叫?成纖維細(xì)胞比例對阻抗傳感搏動幅度和速率的影響。

CM，iPSC-CM細(xì)胞球；CM_Nano，含金-鐵氧化物納米顆粒的細(xì)胞球；CM_Fb_Nano，含金-鐵氧化物納米顆粒并與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞球。搏動特性以阻抗形式量化。

減少肌膜Ca2+內(nèi)流的電起搏揭示了肌力反應(yīng)

       正肌力藥如異丙腎上腺素，通常引起iPSC-CM共培養(yǎng)球體出現(xiàn)變時性反應(yīng)而不是變力性反應(yīng)（圖2a），可能反映了與肌膜相比，iPSC-CM共培養(yǎng)球體的肌漿網(wǎng)Ca2+處理能力相對欠發(fā)達(dá)。通過調(diào)整臺氏液中Ca2+濃度減少肌膜Ca2+內(nèi)流，結(jié)合電起搏以控制搏動速率。在這些條件下，100 nM異丙腎上腺素使iPSC-CM共培養(yǎng)球體搏動幅度增大約兩倍（圖4a）。細(xì)胞外Ca2+濃度滴定，從1.5 mM開始，表明在0.9 mM或更低的濃度時具有濃度依賴性，在0.6 mM更明顯（圖4b）。本研究未檢查起搏的長期效應(yīng)，但在0.9 mM Ca2+沒有異丙腎上腺素刺激的情況下，起搏20s后的zuihouyi次搏動較diyi次搏動幅度已經(jīng)增加了1.24±0.8倍。在對照培養(yǎng)基或1.5mM 臺氏液條件下，這種作用是不存在的（圖4c），這證實了該機制與肌膜Ca2+內(nèi)流減少有關(guān)。盡管iPSC-CM共培養(yǎng)球體的應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系尚未量化，但鑒于共培養(yǎng)球體彈性系數(shù)（剛度）在急性實驗期間保持不變，iPSC-CM共培養(yǎng)球體中的力產(chǎn)生（應(yīng)力）可以由搏動幅度（應(yīng)變）的相對變化來表示。與異丙腎上腺素相似，digaoxin（Na+/K+ATPase抑制劑）和xidinafei（5型磷酸二酯酶抑制劑）在基礎(chǔ)條件下均未引起搏動幅度反應(yīng)的增加。然而，在電起搏或者Ca2+濃度降低的條件下，digaoxin引起明顯的肌力反應(yīng)（搏動幅度增加1.9±0.5倍），而xidinafei則無正性肌力作用（0.8±0.1倍）。這種情況可能由于digaoxin是一種非β-腎上腺素能機制的正性變力因子，而xidinafei在離體心肌細(xì)胞中是通過HCN（超極化激活環(huán)核苷酸門控通道）通道被激活起作用的。

圖4 肌力反應(yīng)受胞外Ca2+濃度和電起搏調(diào)節(jié)。(a)在含0.6 mM Ca2+的臺式液和1 Hz電起搏條件下，100 nM異丙腎上腺素能夠使搏動幅度(肌力反應(yīng))增加。異丙腎上腺素添加前(實線)/后(虛線)。標(biāo)準(zhǔn)化之后搏動曲線寬度變小。(b)在同等搏動條件下對異丙腎上腺素刺激產(chǎn)生的肌力反應(yīng)要求胞外Ca2+水平低于1.2 mM。(c)含0.9 mM Ca2+的臺式液且無異丙腎上腺素參與條件下，搏動20s之后的振幅(實線)較diyi次搏的動振幅(虛線)有所增加，但在對照組或1.5 mMCa2+臺氏液組并沒有這種現(xiàn)象。(d)正性肌力藥物digaoxin(1μM)能夠引起與異丙腎上腺素類似的波動幅度增加，但磷酸二酯酶抑制劑xidinafei(10 μM)不會產(chǎn)生類似效果。

自主搏動的3D球體中細(xì)胞外電位(extracellularfield potentials，EFPs)的檢測

      EFP可以通過記錄自主搏動的iPSC-CM共培養(yǎng)球體來檢測（圖5a）。使用維拉帕米（100 nM）和L型鈣通道激活劑BayK-8644（1 µM）處理，分別導(dǎo)致EFP明顯縮短和延長（圖5b，c），與已知的結(jié)果一致。值得注意的是，Bay K-8644處理后出現(xiàn)了明顯的后去極化延遲（delayedafter-depolarizations，DADs）（圖5c），代表肌漿網(wǎng)Ca2+含量超載，導(dǎo)致Ca2+釋放和內(nèi)向電流的瞬時激活。自主搏動的iPSC-CM共培養(yǎng)球體被檢測到的EFP信號不如阻抗信號強（約為阻抗成功率的50％）。EFP記錄過程中主動收縮力和球體運動的影響尚不清楚，但場電位持續(xù)時間（fieldpotential  duration,  FPD）參數(shù)的藥理調(diào)節(jié)已明確建立。加入金-鐵氧化物納米粒子對EFP沒有明顯影響。基礎(chǔ)條件下，在接種后第7天到第20天之間，共從12個傳感器板中的四個獨立批次中的1037個iPSC-CM共培養(yǎng)球體進(jìn)行定量了EFP和阻抗節(jié)拍檢測（圖5d）。iPSC-CM共培養(yǎng)球體的搏動率隨培養(yǎng)時間降低，并且12天后FPD數(shù)據(jù)的分散性也增加。所有傳感器板的搏動速率和FPD的平均變異率（％CV）值分別為8％和10％。

圖5自主搏動的iPSC-CM共培養(yǎng)球的細(xì)胞外電位EFP檢測。(a)對照。(b)100  nM維拉帕米處理。(c)1 μM  Bay-K8644處理。FPD長度以及DAD變化都很明顯。數(shù)據(jù)來源于接種后7-20天12個獨立記錄板中的1037個成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)球，檢測EFP和阻抗，表明基線FPD和搏動率都比較顯著。

iPSC-CM和共培養(yǎng)球體的復(fù)極機制不同

       與單獨培養(yǎng)的iPSC-CM相比，與小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）共培養(yǎng)會降低共培養(yǎng)球體的搏動率并略微增加場電位持續(xù)時間（fieldpotential  duration, FPD）（BR：41.3±4.7 bpm vs 52.9±6.4 bpm; FPD：0.53±0.06 s vs  0.50±0.07 s）。在短時間內(nèi)（3-10分鐘）使用的空載體，30nM E-4031（hERG通道抑制劑）或100 µM BaCl2（幾個K+通道的抑制劑，包括Kir2.1）處理發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)球體對E-4031的反應(yīng)具有時間依賴性且易造成心律失常。在發(fā)生心律失常之前，   E-4031短時（3分鐘）分別處理單獨培養(yǎng)的iPSC-CM和共培養(yǎng)球體產(chǎn)生的效應(yīng)類似，并且FPD升高（圖6），與其他研究一致。在單獨培養(yǎng)的iPSC-CM中，F(xiàn)PD與搏動速率之間的線性關(guān)系保持不變，這表明與速率校正后的FPD的偏差與心律失常的發(fā)生相吻合。在共培養(yǎng)球體中，F(xiàn)PD明顯偏離了節(jié)律喪失前的基線關(guān)系。這與加入BaCl2（3分鐘）的反應(yīng)形成鮮明對比，BaCl2反應(yīng)在MEF共培養(yǎng)球體中通過增加BR和FPD尺寸而明顯不同（圖6）。共培養(yǎng)球狀體中的BaCl2是增加搏動節(jié)律的unique條件。此外，BaCl2的這些作用在原代培養(yǎng)的人心臟成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)球體（SUPL）中也很明顯。

圖6 iPSC-CM單獨培養(yǎng)和與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的復(fù)極化機制。分別用30nM E-4301(綠色)、100 μM BaCl2(紅色)、DMSO對照(藍(lán)色)處理后，單獨iPSC-CM球(iPSC-CM，實心)和共培養(yǎng)球(CM+Fb,空心)的FPD與搏動率比較。(a)平均數(shù)據(jù)。(b) E-4301 散點圖。(c)BaCl2散點圖。BaCl2處理后僅有iPSC-CM單獨培養(yǎng)細(xì)胞球搏動率顯著升高，表明不同細(xì)胞球中的離子通道表達(dá)可能有差異。

總結(jié)

       本研究分析了1000多個iPSC-CM共培養(yǎng)球體，實現(xiàn)無標(biāo)簽測量其收縮性和EFP。結(jié)合使用聲學(xué)測量和自動處理平臺（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH），開發(fā)出了高效配藥方法。這些方法適用于對iPSC-CM的3D共培養(yǎng)表型分析，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量處理復(fù)雜情況下的iPSC-CM成熟度相關(guān)的特征分析。為驗證該方法的有效性和可擴展性，研究人員證明了iPSC-CM與不同來源的成纖維細(xì)胞的球狀共培養(yǎng)在某些條件下將其搏動幅度提高了一個數(shù)量級。通過降低肌膜Ca2+濃度和電起搏來控制搏動頻率，可以使iPSC-CM通常不存在的正性肌力反應(yīng)出現(xiàn)，并且在不同機制的正性肌力藥物作用下也可以看到相同效果。最后，與共培養(yǎng)細(xì)胞球體相比，iPSC-CM動作電位復(fù)極化顯然涉及到不同的離子通道, 包括不同于E-4031反應(yīng)的BaCl2敏感部分。這些結(jié)果清楚表明，iPSC-CM在表型上對3D共培養(yǎng)的球體環(huán)境有典型的反應(yīng)，并且該系統(tǒng)提供了其他優(yōu)化處理手段（例如細(xì)胞類型、長期光遺傳學(xué)或電起搏、細(xì)胞外基質(zhì)等）。這種新穎并且簡單的研究方法能夠覆蓋iPSC-CM生理學(xué)的多個成熟度相關(guān)的檢測分析，并促進(jìn)了球體共培養(yǎng)模型的進(jìn)一步開發(fā)，該方法可應(yīng)用于疾病建模，iPSC分化，心血管zhiliao領(lǐng)域或藥物安全性驗證等領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：

A  Scalable ApproachReveals Functional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids. SLAS Discovery, DOI：10.1177/2472555220975332.