目前生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展處于快速上升期，后疫情時(shí)代的醫(yī)藥健康行業(yè)，迎來新一輪的變革與機(jī)遇。其中，抗體藥物、細(xì)胞與基因治療藥物被認(rèn)為是未來醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主力軍。無論是抗體藥物的生產(chǎn)還是基于病毒載體的基因治療藥物的制備，都涉及單克隆細(xì)胞株的篩選。在工藝開發(fā)過程中，研發(fā)人員需要分離單細(xì)胞克隆，篩選出高產(chǎn)且穩(wěn)定的細(xì)胞株來建立種子細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫，用于后續(xù)的病毒載體或抗體等藥物的生產(chǎn)。

2020年，美國（FDA）更新了關(guān)于基因治療臨床試驗(yàn)申請(INDs)的化學(xué)、制造和控制指導(dǎo)原則（Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications），內(nèi)容包含穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株開發(fā)及細(xì)胞克隆性確證等。文件指出，細(xì)胞庫（Cell bank）的穩(wěn)定性及純度是一個(gè)需要考慮的重要方面。非單克隆來源的細(xì)胞群中，其細(xì)胞異質(zhì)性相對較高，外源蛋白產(chǎn)量低的細(xì)胞系往往與蛋白高產(chǎn)的細(xì)胞群體競爭，導(dǎo)致高產(chǎn)細(xì)胞個(gè)體占比越來越少，最終隨著傳代次數(shù)的增加，導(dǎo)致細(xì)胞庫或工作庫的質(zhì)量下降，因此，通過單克隆細(xì)胞篩選是提高病毒載體質(zhì)量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細(xì)胞種群降低其異質(zhì)性的方法，通過防止異種細(xì)胞群體的產(chǎn)生，來保障未來生產(chǎn)出的病毒產(chǎn)品的質(zhì)量不受影響。CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對 ELEVECTA® AAV包裝細(xì)胞系的研究數(shù)據(jù)顯示，通過單克隆篩選出的細(xì)胞株其AAV產(chǎn)量要比非單克隆細(xì)胞來源的高10倍左右。除了細(xì)胞基因治療產(chǎn)品，針對抗體藥物，F(xiàn)DA的政策法規(guī)也要求工藝生產(chǎn)細(xì)胞系須是從單個(gè)祖細(xì)胞克隆來源的，生物制藥企業(yè)需提供有力的數(shù)據(jù)證據(jù)以證明藥物研發(fā)過程中的單克隆源性，上述相關(guān)的政策法規(guī)對藥物開發(fā)制備工藝中細(xì)胞單克隆篩選操作及細(xì)胞單克隆源性確證提出了更高的要求。

目前常見的單克隆細(xì)胞篩選方法，包括有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基篩選法、流式細(xì)胞術(shù)分選及單細(xì)胞分離法等。有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基篩選法的優(yōu)點(diǎn)是對細(xì)胞的物理損傷小，弊端是耗時(shí)長、效率低，此外，半固體培養(yǎng)基篩選法采用的熒光抗體對細(xì)胞有毒性，會(huì)影響細(xì)胞活性；并且在半固體培養(yǎng)基上篩選出的高產(chǎn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)可能并不高產(chǎn)。流式細(xì)胞術(shù)的分選效率高，但是由于流式細(xì)胞術(shù)分選采用的內(nèi)部壓力及其高頻震蕩對細(xì)胞造成的損傷較大，分選下來的細(xì)胞活性不高。篩選過程對細(xì)胞的物理或化學(xué)損傷是造成細(xì)胞單克隆率降低的原因之一，除此之外，篩選前細(xì)胞的狀態(tài)對于篩選后是否形成高產(chǎn)的細(xì)胞群落也很重要，若是篩選前細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)不好，篩選后其狀態(tài)也難以變好，何況篩選過程會(huì)對細(xì)胞造成一定的損傷，更不會(huì)奢望其狀態(tài)會(huì)變好。

綜上所述，尋找一種分選效率高，篩選出的陽性克隆細(xì)胞成活率高、生長率高，且單克隆源性證據(jù)可追溯的篩選方法或技術(shù)平臺(tái)對于涉及單克隆細(xì)胞篩選的基因治療、抗體等生物醫(yī)藥行業(yè)顯得尤為重要。

德國 Cytena 公司開發(fā)的單細(xì)胞打印機(jī)（SCP）采用的芯片包含硅膜設(shè)計(jì)，電子控制的制動(dòng)板輕輕擠壓腔體導(dǎo)致腔體體積變小，產(chǎn)生液滴，通過高分辨率的CCD相機(jī)確認(rèn)只含一個(gè)細(xì)胞且該細(xì)胞直徑和細(xì)胞圓度符合設(shè)定范圍的液滴落進(jìn)96/384孔板中，不含細(xì)胞的空液滴和含兩個(gè)及以上細(xì)胞的液滴被氣動(dòng)閥門吸走。通過設(shè)定細(xì)胞直徑和細(xì)胞圓度的質(zhì)控分選過程，不僅提高了單細(xì)胞的分選效率，也篩選到了狀態(tài)更好的細(xì)胞，提高了單克隆細(xì)胞的生長率。

圖1. Cytena 單細(xì)胞打印機(jī)工作原理圖

單細(xì)胞的證據(jù)可追溯性，在cartridge分離細(xì)胞前后的過程中，會(huì)連續(xù)拍取多張細(xì)胞圖片，證實(shí)克隆來自于單個(gè)細(xì)胞。

Cytena單細(xì)胞打印機(jī)進(jìn)入國內(nèi)以來，受到國內(nèi)各大藥企的青睞，得到了眾多用戶的的積極反饋和認(rèn)可。

具體案例分享

一、下面給出了不同地區(qū)一些客戶反饋的單細(xì)胞克隆成活率及單克隆細(xì)胞拍照圖。

圖3. 不同客戶使用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)得到的單細(xì)胞克隆成活率數(shù)據(jù)

（1）杭州客戶

結(jié)論：SCP分選出的細(xì)胞幾乎都是單細(xì)胞，有限稀釋大部分都是空孔。SCP長出來的單克隆數(shù)（70個(gè)）幾乎是有限稀釋的4倍（18個(gè)）。

（2）南京客戶

一共分選2組樣品，在有限稀釋法分選很難生長的細(xì)胞，通過SCP分選后，都獲得了66-75個(gè)單克隆細(xì)胞株，證實(shí)SCP通過細(xì)胞直徑，細(xì)胞圓度等質(zhì)控方式能篩選到狀態(tài)好的細(xì)胞，提高單克隆率。

（3）上海客戶

（4）東北客戶

SCP的分選效率高（如下圖所示），除了周邊孔受到蒸發(fā)效應(yīng)影響生長，中間的孔都是單克隆來源的細(xì)胞，且生長良好。（細(xì)胞類型：CHO細(xì)胞）

（5）成都客戶

二、客戶評價(jià)

三、部分客戶名單