河南省預(yù)防型疫苗工程技術(shù)研究中心，河南省生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院與河南省生物醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心等多個團隊通力合作，在生物制品學(xué)雜志發(fā)表關(guān)于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)狂犬病病毒的成果，該研究為150 L生物反應(yīng)器高密度微載體工藝放大提供了技術(shù)支持，為后期開發(fā)更大規(guī)模高密度微載體反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ)。
狂犬病病毒(rabies virus, RABV)是致死率高的病毒，分布于多種哺乳動物宿主，這些宿主與人類之間存在復(fù)雜的關(guān)系。目前，RABV引起的狂犬病每年造成約5.9萬人死亡。迄今為止，狂犬病發(fā)病后幾乎無治、愈病例，主要通過提前接種疫苗來進行預(yù)防。我國每年人用狂犬病疫苗的消耗量約1600萬人份。對于狂犬病疫苗的制備，RABV大規(guī)模擴增是關(guān)鍵技術(shù)，也是決定成本的重要因素之一。目前主要采用生物反應(yīng)器(借助微載體)培養(yǎng)Vero細胞，擴增RABV，再純化病毒等步驟制備狂犬病疫苗，具有成本較低、技術(shù)較易控制等優(yōu)點，本研究在30 L生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上，嘗試采用150 L生物反應(yīng)器、高密度微載體培養(yǎng)Vero細胞，擴增RABV，以期為規(guī)模化培養(yǎng)RABV，制備狂犬病疫苗提供參考。
應(yīng)用30 L和150 L生物反應(yīng)器，以灌流方式培養(yǎng)Vero細胞和CTN-1V株RABV, Cytodex-1微載體濃度20 g/L，培養(yǎng)溫度36～38℃，DO 20%～60%，pH 7.0～7.4，連續(xù)13 d收獲病毒液，培養(yǎng)過程中取樣檢測細胞密度、病毒滴度，并對病毒收獲液進行無菌和支原體檢查及抗原、宿主細胞蛋白(host cell protein, HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、DNA殘留量檢測。結(jié)果30 L和150 L生物反應(yīng)器的細胞培養(yǎng)密度均可達1.2×107個/mL以上，在培養(yǎng)過程中各時間點的細胞密度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.225～2.173, P=0.096～0.833)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液均在感染后6 d達高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL)，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.000, P=0.374)。2種規(guī)模生物反應(yīng)器病毒收獲液的抗原、HCP、BSA和DNA殘留量基本一致。可用150 L生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)RABV，病毒收獲液符合《中國藥典》三部(2020版)相關(guān)標準。
搖瓶工藝
搖瓶中細胞培養(yǎng)至第4天時，呈致密單層，接種RABV毒種。
生物反應(yīng)器工藝
細胞培養(yǎng)過程中2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細胞密度變化趨勢相似。細胞培養(yǎng)至第4天，密度達12.0×106個/m L以上，30 L生物反應(yīng)器的細胞密度(12.3×106個/m L)高于150 L生物反應(yīng)器(12.1×106個/m L)，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.138, P=0.319)。接毒后細胞持續(xù)生長一段時間，2種規(guī)模生物反應(yīng)器細胞密度均在第6天達最、高，分別為13.3×106和13.0×106個/m L。隨著病毒培養(yǎng)時間的延長，細胞密度呈下降趨勢。2種規(guī)模生物反應(yīng)器在培養(yǎng)過程中各時間點的細胞密度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.225～2.173, P=0.096～0.833)。細胞密度變化曲線見圖1；接種細胞后，細胞貼附在微載體表面，形態(tài)飽滿，無游離細胞，第4天呈致密單層，見圖2；接種病毒后，細胞逐漸發(fā)生病變，從微載體上脫落，死亡，第13天大部分細胞已脫落，見圖3。
圖1
圖2
圖3
病毒收獲液檢定病毒滴度變化
30和150 L生物反應(yīng)器中細胞感染2 d后收獲的第1組病毒液滴度平均值分別為(7.60±0.14)和(7.63±0.09)lg LD50/m L；感染4 d后，2種規(guī)模生物反應(yīng)器的細胞密度均下降、收獲液病毒滴度均增加，均在感染后6 d達高病毒滴度，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.000, P=0.374)。隨后病毒滴度緩慢下降，培養(yǎng)結(jié)束時，2種規(guī)模生物反應(yīng)器的收獲液病毒滴度均為(7.53±0.12)lg LD50/m L。見表1和圖4。表明從30 L放大至150 L的工藝可獲得高滴度的病毒收獲液。
表1
圖4
結(jié)果
搖瓶培養(yǎng)目前主要作為細胞培養(yǎng)擴增步驟，直接應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)越來越少。單個搖瓶產(chǎn)能較小，規(guī)模化生產(chǎn)需至少數(shù)十個搖瓶同步進行，導(dǎo)致人工操作復(fù)雜且強度大，存在一定的暴露操作風(fēng)險。搖瓶培養(yǎng)技術(shù)不再是規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展方向。
應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細胞是疫苗制備的關(guān)鍵技術(shù)，是重要的發(fā)展方向之一。且生物反應(yīng)器易操控，適合規(guī)模化放大，應(yīng)用反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Vero細胞具有明顯優(yōu)勢。生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更高的收益率，生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作，可監(jiān)測和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應(yīng)器中的傳感器和控制元件數(shù)量，可以更好的進行培養(yǎng)工藝條件的篩選，優(yōu)化。工藝簡單、操作靈活，有良好的適用性；培養(yǎng)工藝容易放大，可為生物體生長和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)；管路布置較為簡單，能提供較好的無菌條件，細胞生長過程中不易污染。該研究在30 L生物反應(yīng)器規(guī)模實驗的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了在150 L生物反應(yīng)器進行微載體濃度20 g/L的Vero細胞培養(yǎng)，并接種RABV，細胞病變過程正常且可控，病毒收獲液滴度可高達8.5 lg LD50/m L, 30和150 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的終末代細胞各項檢測均符合《中國藥典》三部(2020版)要求，為后期開發(fā)更大規(guī)模高密度微載體生物反應(yīng)器工藝奠定基礎(chǔ)。
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