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小鼠原代胃Cajal間質細胞操作要點

來源:上海谷研實業有限公司   2025年07月17日 15:46  

小鼠原代胃Cajal間質細胞操作要點

培養條件優化

1. 培養基選擇與補充: 建議使用DMEM/F12基礎培養基,添加10%胎牛血清(FBS),1%雙抗,以及以下關鍵生長因子:

干細胞因子(SCF,50ng/ml): 促進ICC存活和增殖。

胰島素樣生長因子-1(IGF-1,25ng/ml): 增強細胞代謝活性。

肝細胞生長因子(HGF,10ng/ml): 維持ICC表型,抑制分化。

2. 培養環境: 將細胞置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中,保持濕度飽和。由于ICC對氧化應激敏感,建議在培養箱中維持低氧條件(5% O2),以模擬其體內微環境。

3. 換液頻率:換液應在接種后24小時進行,以去除未貼壁的細胞碎片。之后每2-3天換液一次,換液時保留約1/3舊培養基,以維持細胞分泌的自分泌因子。

細胞鑒定與功能檢測

1. 免疫熒光鑒定:使用特異性抗體標記ICC的標志物,如c-Kit(CD117)、ANO1(TMEM16A)和vimentin。建議進行共標實驗,例如c-Kit/ANO1雙標,以提高鑒定準確性。

2. 電生理特性檢測: 采用膜片鉗技術記錄ICC的自發電活動,觀察其起搏電流(如:周期性內向電流)和慢波電位,這是ICC功能的重要指標。

3. 鈣成像: 使用Fluo-4 AM等鈣離子熒光探針,檢測ICC內鈣振蕩的頻率和幅度,評估其鈣信號傳導功能。

常見問題與解決方案

細胞貼壁率低:檢查膠原蛋白包被是否均勻,嘗試增加包被時間(4℃過夜)。亦可使用纖維連接蛋白(fibronectin)輔助包被。

細胞增殖緩慢: 確認生長因子活性,建議分裝保存避免反復凍融。檢查血清批次,必要時更換優質血清。

細胞表型丟失: 避免過度傳代(建議P3以內),縮短消化時間,并定期進行免疫熒光鑒定。

注意事項

無菌操作: ICC培養對無菌要求高,所有操作需在超凈臺內完成,試劑需經0.22μm濾膜過濾。

輕柔操作: ICC細胞膜脆弱,吹打時避免產生氣泡,建議使用寬口吸頭。

數據記錄: 詳細記錄細胞形態、增殖狀態和實驗參數,便于追溯問題。


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