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上海金穗生物科技有限公司
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Topl0F’細(xì)胞中的電轉(zhuǎn)化及文庫儲存

時間:2013-3-11閱讀:323
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[方法]
1.加2~3ul純化的連接反應(yīng)物(大值為0.3ug DNA)到80ul的*0F’電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕搖晃混合。使用30ng(2ul)的pUCl9控制電轉(zhuǎn)化效率。
2.將細(xì)胞+DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到已冷卻的0.2 cm細(xì)胞電轉(zhuǎn)化管,并冰浴3分鐘。
3,將Gene Pulser Plus電穿孔儀設(shè)置為2.5kV脈沖,電容器設(shè)為25uF,脈沖控制器設(shè)為200ns。
4.用紙巾干燥電轉(zhuǎn)化管,然后將它放在電轉(zhuǎn)化箱中,使用一個脈沖(寄存時間常量必須為4.5~5.0毫秒)。
5.立即加lmlLB到電擊管中,打散細(xì)胞,然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml聚丙烯試管中。
6.在37℃下振蕩,使細(xì)胞能夠表達(dá)抗抗生素的標(biāo)記。
7.組合所有的電轉(zhuǎn)化樣品,通過100ul適當(dāng)稀釋后均勻地倒在小LBAT平板上來確定文庫的大小,用pUCl9控制電轉(zhuǎn)化能產(chǎn)生大約3×107的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
8.在20℃,2500g下旋轉(zhuǎn)組合電轉(zhuǎn)化樣品15分鐘,在0.5XLBAT起始體積中打散沉淀顆粒,將1 ml細(xì)胞懸浮液涂抹在每一平方LBAT平板上。
9.在37℃過夜孵育該板。
10.在每個平方板上灑上10ml LBAT以獲得文庫,,用無菌延輾機敲碎細(xì)胞,將已打散的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml聚丙烯試管中。
11.重復(fù)實驗方案12.10,用5m1 LBAT除去板上留下的細(xì)胞。
12.在600nm測量細(xì)胞懸浮液的光密度(OD),如果有必要,可以將濃縮的細(xì)胞系稀釋到每毫升LBAT 40 OD600nm單位。
13.制備甘油菌,將5ml的甘油加到5ml的濃縮細(xì)胞系中,混合后均等地分到1m1聚丙烯冷凍管中,在-70℃冷凍及儲存,后細(xì)胞濃度將是每毫升20 OD600nm位,這大約是每毫升1.6×1010個細(xì)胞。

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