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上海金穗生物科技有限公司
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用噬菌體上清和人血清進(jìn)行ELISA

時間:2013-3-13閱讀:289
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[方法]
1.將200ul濃度為1ug/ml的抗pⅢmAb 57D1①包被緩沖液,分別加在多孔板各個板孔 中。4℃孵育過夜。
2.棄去包被液,并用PBST洗滌數(shù)次。
3.每孔加250ul封閉液,37℃孵育60分鐘。包被板可立即使用或在一20℃保存數(shù)周。
4.每孔加100ul封閉液和100ul如上述制備的清亮噬菌體上清。在37℃下孵育60分鐘以 使噬菌體顆粒結(jié)合。
5.將人血清在200ul封閉液中,室溫預(yù)孵育30分鐘;其中包含2.5ul細(xì)菌提取物、大約 5 × 1010pfuPEG—濃縮f1Rl—11.1噬菌體以及10ul來自無關(guān)大鼠雜交瘤細(xì)胞上清。當(dāng) 檢測單個克隆時,采用1:100比例稀釋血清; 當(dāng)檢測噬菌體文庫時,采用1:400比 例稀釋血清。此步可以減少針對野生型噬菌體的血清抗體、細(xì)菌污染物及大鼠抗pⅢ單 抗的干擾。
6.從包被板中棄去噬茵體上清,并用PBST充分洗滌板孔。
7.在每孔中加200ul預(yù)孵育的血清混合物,在室溫下孵育2小時。
8.除去血清混合物,用PBST充分洗滌板孔。在每孔中加入200ul堿性磷酸酶標(biāo)記二抗, 室溫孵育60分鐘。
9.除去二抗溶液,并用PBST充分洗滌。用底物緩沖液快速洗滌板孔。
10.在每孔中加200ul顯色液,37℃暗處孵育15—60分鐘。
11.用自動酶標(biāo)儀將A405和A655間的差值作為結(jié)果記錄。

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