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花生四烯酸5脂加氧酶ELISA試劑盒實驗步驟

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花生四烯酸5脂加氧酶(5-lipoxygenase)ELISA試劑盒以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

實驗步驟(建議方案 ): 

石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度 

1.烤片: 將待做切片置于切片架上,于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr; 

2.脫蠟: 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min; 

3.水化: 切片經(jīng)下行酒精水化,無水乙醇 5min,95%乙醇 2 次(每次 2min),85%乙醇 2 min;75%乙醇 2min,自來水沖洗,ddH2O 洗 2×2min; 

4.抗原修復: 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復,常采用高壓、微波(溫度達到 98~100℃)或酶消化修復法,室溫自然冷卻,自來水沖洗,ddH2O 洗 2×2min,TBS 洗滌(2×2min)(具體修復方法見附 1)* 注:有些抗原勿需修復,直接進入第 5 步封閉。 

5.封閉: 滴加試劑 B,37℃濕盒孵育 30 min; 

6.加一抗:滴加用試劑 C(即用型一抗),37℃濕盒孵育 2 hr 或 4℃過夜; 

7.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min); 

8.封閉: 滴加試劑 B,37℃濕盒孵育 10 min; 

9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑 D),37℃濕盒中孵育30 min; 

10.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min); 

11.封閉: 滴加試劑 Tween 20,37℃濕盒孵育封閉 20 min; 

12.加 HRP-SA: 滴加用試劑 C 稀釋的試劑 E(1:50~200,終濃度 5~20 nM),37℃濕盒中孵育 30 min; 

13.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min),TBS 洗滌(2×5 min); 

14.顯色:應用 DAB 溶液(試劑 F)顯色; 

15.復染:自來水充分沖洗,復染,脫水,透明; 

16.封片: 待組織標本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片; 

17.花生四烯酸5脂加氧酶(5-lipoxygenase)ELISA試劑盒觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。 

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