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胞漿異檸檬酸脫氫酶(ICDHc)樣本的前處理

時間:2021/7/7閱讀:169
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胞漿異檸檬酸脫氫酶(ICDHc)樣本的前處理

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿 600g,4℃離心5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的 NOX(此步可選做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于NOX活性測定。

血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至600nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

(1)試劑四于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min。

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五,混勻,記錄600nm處20s時吸光值A1和1min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

NOX 活力單位的計算

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)NOX活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變

 

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